O auala e su'esu'e ai mole e iai le malosi e maua ai se voluma tele o le nucleic acid e ala i le fa'ateleina o fa'amaumauga o lo'o maua i fa'ata'ita'iga.E ui ina aoga lea mo le fa'ataga ma'ale'ale su'esu'ega, e fa'ailoa mai ai fo'i le ono fa'aleagaina e ala i le fa'asalalauina o le aerosol fa'ateleina i totonu ole si'osi'omaga su'esu'e.A'o faia ni su'esu'ega, e mafai ona faia ni faiga e 'alofia ai le fa'aleagaina o reagents, mea faigaluega falesu'esu'e ma le avanoa nofoa, ona o ia fa'ama'i e mafai ona fa'atupu ai fa'ai'uga sese-lelei (po'o sese-leaga).

Ina ia fesoasoani i le faʻaitiitia o le ono afaina ai, e tatau ona faʻatinoina le Good Laboratory Practice i taimi uma.Aemaise lava, e tatau ona faia ni puipuiga e uiga i itu nei:

1. Taulimaina reagents
2. Fa'atulagaina o avanoa faigaluega ma meafaigaluega
3. Fa'aoga ma fa'amama fautuaga mo le avanoa mole mole fa'apitoa
4. Fautuaga masani mole mole biology
5. Pulea totonu
6. Tusitala

1. Taulimaina reagents

Fa'amalo fa'apuupuu fa'agaau fa'afefe a'o le'i tatalaina e 'alofia ai le fa'atupuina o aerosol.Aliquot reagents e aloese ai mai le tele o le malulu ma le faaleagaina o matai oloa.Fa'ailoa manino ma fa'aigoa uma fa'aa'i ma fa'agaioiga ma fa'atumauina ogalaau o lo'o fa'agaoioi ma numera fa'ato'a fa'aaogaina i su'ega uma.Fa'aigoa uma mea fa'afofoga ma fa'ata'ita'iga e fa'aaoga ai fautuaga fa'amama.Aʻo leʻi faʻatau, e fautuaina e faʻamaonia ma le kamupanī o faʻamaʻi faamama e fetaui ma le ituaiga paipa e faʻaaogaina.

2. Fa'atulagaina o avanoa faigaluega ma meafaigaluega

E tatau ona fa'atulaga avanoa faigaluega e fa'amautinoa ai o le tafega o galuega e tupu i le tasi itu, mai nofoaga mama (mua'i-PCR) i nofoaga palapala (post-PCR).O puipuiga lautele o lo'o mulimuli mai o le a fesoasoani e fa'aitiitia le avanoa o le fa'aleagaina.Fai ni potu fa'apitoa, po'o ni vaega laiti fa'apitoa, mo: tapenaga mastermix, su'ega nucleic acid ma fa'aopoopo fa'ata'ita'iga DNA, fa'ateleina ma le fa'aogaina o mea fa'asili, ma su'esu'ega o oloa, fa'ata'ita'iga gel electrophoresis.

I nisi tulaga, o le i ai o potu eseese e 4 e faigata.O se filifiliga e mafai ae itiiti le mana'omia o le faia lea o le fa'afefiloiga mata'i i totonu o se nofoaga e teu ai, fa'ata'ita'iga o le kapoti fa'amama fa'alamina.I le tulaga o le faʻapipiʻiina o le PCR faʻapipiʻi, o le sauniuniga o le mastermix mo le tali lona lua e tatau ona saunia i le vaega 'mama' mo sauniuniga mastermix, ae o le inoculation ma le oloa PCR muamua e tatau ona faia i totonu o le potu faʻalautele, ma pe a mafai. i totonu o se nofoaga fa'apitoa e teu ai (fa'ata'ita'iga o le kapoti tafe).

E mana'omia e potu ta'itasi se seti tu'ueseese o paipa fa'aigoa manino, fa'amama fata, fata fa'alava, vortexes, centrifuges (pe a talafeagai), peni, fa'ato'aga fa'asu'esu'e lautele, ofu su'esu'e ma atigipusa totigilima o le a tumau i o latou fale faigaluega.E tatau ona fufulu lima ma sui totigilima ma ofu su'esu'e pe a fealua'i i le va o nofoaga fa'apitoa.E le tatau ona ave'ese mai se vaega palapala i se nofoaga mama.Afai e tula'i mai se fa'alavelave matuia e mana'omia ai le toe fa'afo'i i tua o se mea fa'afefe po'o se mea faigaluega, e tatau ona fa'amama muamua ile 10% sodium hypochlorite, soso'o ai ma le solo i lalo ole vai mama.

Manatua

Ole vaifofo ole 10% ole sodium hypochlorite e tatau ona fa'afou i aso uma.A fa'aogaina mo le fa'amama, e tatau ona tausisia se taimi fa'afeso'ota'i itiiti ifo i le 10 minute.
E le gata i lea, e mafai ona fa'aoga oloa fa'atau fa'atau e fa'amaonia e pei o mea e fa'aleagaina ai luga ole DNA pe afai e le fa'atagaina e fautuaga mo le saogalemu i le lotoifale le fa'aogaina ole sodium hypochlorite po'o le sodium hypochlorite e le talafeagai mo le fa'amama o vaega u'amea o meafaigaluega.

O le mea lelei, e tatau i le aufaigaluega ona usita'ia le fa'atonuga o galuega ma 'aua le alu ese mai nofoaga palapala (post-PCR) toe fo'i i nofoaga mama (mua'i-PCR) i le aso lava e tasi.Peitaʻi, e iai taimi e lē mafai ai ona ʻalofia.A tula'i mai sea tulaga, e tatau i tagata faigaluega ona fa'aeteete e fufulu lelei lima, sui totigilima, fa'aoga le ofutino falesu'esu'e ma aua ne'i toe fa'ailoa mai so'o se meafaigaluega latou te toe mana'o e ave i fafo o le potu, e pei o tusi a le fale suesue.O ia faiga fa'atonutonu e tatau ona fa'amamafaina i a'oa'oga a le aufaigaluega i metotia mole.

A uma ona fa'aoga, e tatau ona fa'amama avanoa nofoa i le 10% sodium hypochlorite (sosoo ai ma le vai fa'amama e aveese ai le pisia o totoe), 70% ethanol, po'o se vaila'au fa'atau fa'atau e fa'atau ai DNA.O le mea e sili ona lelei, e tatau ona fa'apipi'i lamepa ultra-violet (UV) ina ia mafai ai ona fa'amama e ala i le fa'avevelaina.Ae ui i lea, o le fa'aogaina o lamepa UV e tatau ona fa'atapula'a i nofoaga tapuni o galuega, fa'ata'ita'iga o kapoti saogalemu, ina ia fa'atapula'aina le fa'aalia ole UV a le aufaigaluega su'esu'e.Fa'amolemole ia usita'i i fa'atonuga a le gaosiga mo le tausiga o lamepa UV, fa'avevela ma le fa'amamāina ina ia mautinoa o lo'o tumau pea le lelei o lamepa.

Afai e fa'aaoga le 70% ethanol nai lo le sodium hypochlorite, e mana'omia le fa'avevelaina ma le malamalama UV e fa'amae'a ai le fa'amama.
Aua le fa'amama le vortex ma centrifuge i le sodium hypochlorite;nai lo lena, solo i lalo i le 70% ethanol ma faʻaalia i le malamalama o le UV, pe faʻaaoga se faʻamaʻi faʻaleagaina DNA faʻatau.Mo masaa, fa'afeso'ota'i le kamupani gaosi oloa mo nisi fautuaga fa'amamā.Afai e fa'atagaina e fa'atonuga a le gaosiga, e tatau ona fa'amama fa'amama paipa i le autoclave.Afai e le mafai ona fa'amama paipa, e tatau ona lava le fa'amama i le 10% sodium hypochlorite (sosoo ai ma le solo solo i lalo ole vai fa'amama) po'o le fa'atauina ole DNA fa'atau fa'ama'i fa'atau ma soso'o ai ile fa'aalia ole UV.

O le fa'amamāina o le sodium hypochlorite e maualuga le pasene e ono fa'aleagaina ai paipa palasitika ma u'amea pe a fai i taimi masani;siaki muamua fautuaga mai le gaosi oloa.O mea faigaluega uma e mana'omia ona fa'avasegaina i taimi uma e tusa ai ma le fa'atonuga o le gaosiga.O se tagata ua tofia e tatau ona nafa ma le faʻamautinoaina o loʻo tausisia le faʻatulagaina o faʻasologa, faʻamautu faʻamaumauga o loʻo faʻamauina, ma faʻaalia manino igoa i luga o meafaigaluega.

3. Fa'aoga ma fa'amama fautuaga mo le avanoa mole mole fa'apitoa

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix sauniuniga: E tatau ona sili ona mama i avanoa uma e fa'aoga mo le tapenaga o su'esu'ega mole mole ma e tatau ona avea ma se kapoti fa'aigoa e fa'apipi'iina i se moli UV.Fa'ata'ita'iga, su'e nucleic acid ma mea fa'aopoopo PCR e le tatau ona tagofia i lea vaega.E tatau ona teu i totonu o le pusaaisa (po'o le pusaaisa, e tusa ai ma fautuaga a le gaosi oloa) i le avanoa e tasi, e sili ona lelei i tafatafa o le kapoti fa'afefe o le laminar po'o le vaega a'o le'i faia le PCR.E tatau ona sui totigilima i taimi uma pe a ulu atu i le vaega a'o le'i faia le PCR po'o le kapoti fa'amama moli.

E tatau ona fa'amamāina le vaega a'o le'i faia le PCR po'o le kapoti fa'amalo a'o le'i fa'aaogaina ma pe a uma fo'i ona fa'apea: Tape i lalo mea uma o lo'o i totonu o le kapeneta, eg paipa, pusa pito, vortex, centrifuge, fata paipa, peni, ma isi fa'atasi ma le 70% ethanol po'o se fa'atau fa'amago DNA fa'atau, ma fa'ataga.I le tulaga o se vaega o lo'o tapuni, fa'ata'ita'iga o le kapoti fa'afefe, fa'aali le pulou i le moli UV mo le 30 minute.

Manatua

Aua ne'i fa'aalia mea fa'afoliga i le malamalama UV;na'o le ave i totonu o le kapeneta pe a mama.Afai e fai le PCR fa'aliliuga fa'aliliu, e mafai fo'i ona fesoasoani le solo'ese o luga ma mea faigaluega i se vaifofo e fa'aumatia ai RNases pe a fa'afeso'ota'i.E mafai ona fesoasoani lenei mea e aloese ai mai taunuuga le lelei mai le faʻaleagaina ole enzyme ole RNA.A maeʻa le faʻamama ma aʻo leʻi saunia le mastermix, e tatau ona toe sui totigilima, ona sauni lea o le kapeneta e faʻaoga.

Mu'i-PCR: Su'ega nucleic acid/fa'aopoopo fa'ata'ita'iga:

O le nucleic acid e tatau ona aveese ma taulimaina i se vaega lona lua ua filifilia, e faʻaaoga ai se seti o paipa, faʻamaʻi faʻamaʻi, fata paipa, totigilima fou, ofutino falesuesue ma isi meafaigaluega. mastermix tubes poʻo papatusi.Ina ia aloese mai le faaleagaina o faʻataʻitaʻiga o le nucleic acid o loʻo suʻesuʻeina, e fautuaina e sui totigilima aʻo leʻi faʻaogaina faʻatonuga lelei poʻo tulaga ma faʻaaoga se seti o paipa.E le tatau ona paipa i totonu o lenei vaega o mea fa'apipi'i PCR ma mea fa'aopoopo.O fa'ata'ita'iga e tatau ona teu i totonu o pusaaisa fa'apitoa po'o pusaaisa i le vaega lava e tasi.E tatau ona fa'amama le avanoa faigaluega fa'ata'ita'i i le auala tutusa e pei o le va'aiga mastermix.

Post-PCR: Faʻateleina ma le faʻaogaina o le oloa faʻateleina

O lenei avanoa fa'apitoa e mo le fa'agasologa o le fa'asili ma e tatau ona va'ava'ai tino mai vaega a'o le'i faia le PCR.E masani lava ona iai mea e fa'aogaina ai le thermocyclers ma fa'asologa o taimi moni, ma e tatau ona i ai se kapoti fa'asolo mo le fa'aopoopoina o le oloa 1 PCR ta'amilosaga i le ta'amilosaga 2 tali, pe a fai o lo'o faia le PCR nested.Ole PCR reagents ma le nucleic acid ua maua mai e le tatau ona taulimaina i lenei vaega ona e maualuga le lamatiaga o le faaleagaina.O lenei vaega e tatau ona i ai se seti eseese o totigilima, ofu su'esu'e, fata ipu ma fa'apa'au, paipa, fa'amatalaga faamama, talone ma isi mea faigaluega.O paipa e tatau ona centrifuge a'o le'i tatalaina.E tatau ona fa'amama le avanoa faigaluega fa'ata'ita'i i le auala tutusa e pei o le va'aiga mastermix.

Post-PCR: Iloiloga o oloa

O le potu lea e mo mea faigaluega e su'e ai oloa, fa'ata'ita'iga, tane eletise eletise, pusa eletise, UV transilluminator ma le faiga o fa'amaumauga gel.O lenei vaega e tatau ona i ai seti eseese o totigilima, ofu su'esu'e, fata ipu ma fa'aau, paipa, fa'amama fa'amau, talone ma isi mea faigaluega.E leai se isi mea e mafai ona aumaia i totonu o lenei vaega, e le aofia ai le valiina o le vali, faʻailoga mole ma le gel agarose, ma mea faʻapipiʻi.E tatau ona fa'amama le avanoa faigaluega fa'ata'ita'i i le auala tutusa e pei o le va'aiga mastermix.

Fa'amatalaga taua

O le mea lelei, e le tatau ona ulufale i potu a'o le'i faia le PCR i le aso e tasi pe afai ua uma ona faia galuega i potu pe a uma le PCR.Afai e matua le mafai lava ona alofia lenei mea, ia mautinoa e fufulu muamua lima ma o lo'o ofuina ni ofu su'esu'e i totonu o potu.E le tatau ona ave tusi ma pepa i totonu o potu a'o le'i faia le PCR pe afai na fa'aaogaina i potu pe a mae'a le PCR;pe a mana'omia, ave fa'alua lolomiga o protocols/fa'ata'ita'iga ID, ma isi.

4. Fautuaga masani mole mole biology

Fa'aaogā totigilima e leai se pauta e 'alofia ai le fa'alavelave fa'ata'ita'iga.O le faiga sa'o o paipa e taua tele i le fa'aitiitia o le fa'aleagaina.E le sa'o le paipa e mafai ona sausau ai pe a tufa vai ma fa'atupu ai aerosol.Fa'ata'ita'iga lelei mo le paipa sa'o e mafai ona maua i so'otaga nei: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes a'o le'i tatalaina, ma tatala ma le faaeteete ina ia aloese mai le pipii.Tapuni faagaau pe a uma ona faʻaoga e aloese ai mai le tuʻuina atu o mea leaga.

Pe a faia ni gaioiga se tele, saunia se paluga matai e tasi o loʻo i ai mea faʻapitoa masani (faʻataʻitaʻiga vai, dNTPs, paʻu, primers ma enzyme) e faʻaitiitia ai le aofaʻi o faʻaliliuga faʻafefe ma faʻaitiitia le faʻamataʻu o le faʻaleagaina.E fautuaina le setiina o le mastermix i luga o le aisa poʻo se poloka malulu.O le fa'aogaina o le Enzyme Hot Start e mafai ona fesoasoani e fa'aitiitia le gaosiga o oloa e le fa'apitoa.Puipui reagents o lo'o i ai su'esu'ega fa'alelei mai le malamalama ina ia 'alofia ai le fa'aleagaina.

5. Pulea totonu

Fa'aaofia ai fa'atonuga lelei, fa'amaonia lelei ma fa'aletonu, fa'atasi ai ma le pulea e leai se fa'ata'ita'iga i fa'agaioiga uma, ma se laina fa'asolo fa'asologa fa'atele mo tali fa'atele.Ole fa'atonuga lelei e le tatau ona matua malosi e tula'i mai ai se lamatiaga fa'aleagaina.Fa'aaofia ai fa'atonuga lelei ma le le lelei pe a fa'atino le su'eina o le nucleic acid.

E fautuaina ina ia fa'apipi'i fa'atonuga manino i vaega ta'itasi ina ia iloa e tagata fa'aoga tulafono o amioga.O su'esu'ega su'esu'e e iloa ai le maualalo o le DNA po'o le RNA i fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'i e ono mana'o e fa'aoga le fua fa'aopoopo mo le puipuiga o le tu'ufa'atasia o faiga e fa'aogaina ai le ea ma le mamafa la'ititi o le ea i totonu o potu a'o le'i faia le PCR ma sina le lelei o le ea i totonu o potu pe a uma le PCR.

O le mea mulimuli, o le atina'eina o se fa'amautinoaga lelei (QA) fuafuaga e fesoasoani tele.O sea fuafuaga e tatau ona aofia ai lisi o faʻamaumauga faʻapitoa ma mea faigaluega, tulafono mo le teuina o pusa ma reagents, lipoti o taunuʻuga faʻatonutonu, polokalame aʻoaʻoga a le aufaigaluega, faʻafitauli algorithms, ma gaioiga faʻaleleia pe a manaʻomia.

6. Tusitala

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Mataupu 3: Faʻatulagaina se falesuesue qPCR.Ose pepa ta'iala mo le su'eina o vai fa'afiafia e fa'aaoga ai le USEPA qPCR metotia 1611. Lansing- Michigan State University.

Soifua Maloloina Egelani, NHS.Tulaga fa'a UK mo su'esu'ega o meaola ninii: Fa'ata'ita'iga Lelei a le Falesu'esu'e pe a fa'atino su'ega fa'alautele mole).Ta'iala Tulaga.2013;4(4):1–15.

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Schroeder S 2013. Faʻaleleia masani o centrifuges: faʻamamaina, faʻaleleia ma faʻamaʻi faʻamaʻi o centrifuges, rotors ma adapters (Pepa Paʻepaʻe Nu. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) mo suʻesuʻega faʻavae mole mole faʻaaogaina i fale suʻesuʻe suʻesuʻe, I: Akyar I, faatonu.Tele alaleo o le pulea lelei.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.